CHUỘT VÀ VAI TRÒ CỦA NÓ TRONG NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC
NGUYỄN ĐÌNH NGUYÊN
Chuột là một loại động vật gắn liền với sinh hoạt văn hoá của con người khá lâu đời, đặc biệt với nền văn hoá lúa nước như Việt Nam. Sự hoà nhập giữa loài chuột với con người trong một quần thể định cư có lẽ được xác định từ thời kỳ đồ đá mới (neolithic) ở Thổ Nhĩ Kỳ khoảng 6500-5650 trước Công Nguyên;[1] và chuột nhà đã chứng tỏ là loại động vật có vú có khả năng thích nghi cao nhất với các quần thể định cư đa dạng của con người.
Tuy nhiên, mối quan hệ giữa chuột và người lại là cảnh “đồng sàng dị mộng”, chuột luôn là đối tượng để con người “tìm và diệt” vì đặc tính sinh thái và tác hại của loài chuột đối với con người. Trong dân gian Việt Nam con chuột được nhắc đến như là một biểu tượng của những điềm gở, những tính xấu hơn là sự gắn bó thân thiện và hữu ích. Ngay cả đối với Tây phương, đến tên gọi tiếng Anh “mouse” cũng mang một nghĩa xấu. Mouse, bắt nguồn từ gốc Latin là “mus”, rồi tiếng Hy Lạp là “mys” và cuối cùng là du nhập vào tiếng Phạn cổ là “mush”,[2] đều có nghĩa là “ăn cắp”. Vâng, chúng ta đã đặt cho loài chuột một cái tên định danh, là kẻ cắp, kẻ ăn cắp thực phẩm của con người từ khi nông nghiệp ra đời.
Cho dù cho đến nay, chuột trong mắt con người vẫn là một loại sinh vật gây hại đáng ghét, một “kẻ cắp chuyên nghiệp”. Thế nhưng qua hàng thế kỷ nay, con người đang trở thành “kẻ cắp” trở lại đối với loài chuột; thậm chí, chuột đã trở thành “ân nhân” bất đắc dĩ của con người. Con người đã ăn cắp những gì, và ăn cắp như thế nào từ loại sinh vật thấp kém này, nhân năm Chuột (Mậu Tý 2008), bài viết này đề cập đến vai trò của chuột trong nghiên cứu y sinh học, như một sự minh oan cho loài chuột.
Sơ lược về việc sử dụng động vật trong nghiên cứu y sinh thực nghiệm
Việc sử dụng động vật để áp dụng trong nghiên cứu khoa học sinh lý học có từ rất lâu đời; tuy nhiên theo tài liệu còn lưu trữ được cho đến nay thì Galen ở Pergamum (130-200 sau Công Nguyên), được coi là ông tổ của ngành phẫu thuật của y khoa từ thời Hippocrates, là người đầu tiên thực hiện phẫu tích và nghiên cứu trên mô hình động vật là lợn (heo), khỉ không đuôi (barbary ape), và chó để nghiên cứu sinh lý học áp dụng cho con người sau khi bộ luật La Mã nghiêm cấm mổ tử thi.[3] Và cũng từ đó mà việc sử dụng động vật trong nghiên cứu y học đã đóng góp cho nhân loại một kho tàng tri thức vô giá về các mặt cơ thể giải phẫu, sinh lý học, bệnh lý học và sau này là mô hình thử nghiệm và di truyền học.
Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, trong những thập niên cuối của thế kỷ XX, có nhiều mô hình nghiên cứu phi động vật (quan sát và giải phẫu tử thi và sử dụng dòng tế bào người) để thay thế mô hình động vật, nhưng cũng chỉ đem lại giá trị khoa học nhất định; và động vật vẫn là một trong những mô hình được sử dụng ưu thế nhất trong nghiên cứu y sinh học. Mỗi năm có khoảng 17 đến 23 triệu con vật được sử dụng để nghiên cứu.[4] Trong số đó, chuột (cả chuột hoang dại [rat] và chuột nhà [mouse]) chiếm đến 95% các nghiên cứu trên mô hình động vật.[4,5] Sở dĩ chuột được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y khoa là do kích thước nhỏ, giá thành tương đối không đắt đỏ, dễ nuôi, sinh sản nhanh, đặc biệt đời sống ngắn (2-3 năm) nên có thể theo dõi được hết đời sống và có thể theo dõi được cả vài thế hệ. Nhưng điểm quan trọng và quý giá nhất nhất là đặc điểm sinh lý và di truyền học của chuột rất gần với con người. Thực tế, mặc dù tinh tinh (chimpanzee) có cấu trúc di truyền DNA 99% giống với con người, và chuột chia sẻ có 98% bộ gen với con người, nhưng chuột vẫn luôn luôn là mẫu hình nghiên cứu được ưu tiên hàng đầu trong nghiên cứu y học. Trong một thập niên gần đây, các nhà khoa học còn nâng cấp mô hình nghiên cứu chuột lên một tầm cao mới là có thể làm thay đổi cấu trúc gen trong chuột để gây ra các bệnh lý giống như bệnh lý ở người.
Tại sao không thể dùng các mô hình thay thế động vật trong nghiên cứu y sinh?
Trên nguyên tắc, một khi có thể sử dụng được mô hình thay thế động vật là các nhà nghiên cứu lập tức áp dụng ngay. Nhiều mô hình thay thế động vật được áp dụng rộng rãi hiện nay bao gồm mô hình điện toán hóa, mô hình trên các dòng tế bào phân lập, nuôi cấy và một số các mô hình phi động vật khác. Thí dụ như mô hình điện toán hóa thường được sử dụng trong việc sàng lọc và xác định mức độ gây độc của các chất trong giai đoạn khởi đầu của nghiên cứu thực nghiệm trên các mô và tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, các mô hình trên động vẫn vẫn còn giá trị, ví dụ như bệnh mù, chúng ta không thể nghiên cứu trên mô hình phi động vật hay bệnh cao huyết áp không thể nghiên cứu được trên các tế bào nuôi cấy.
Các bộ phận sống cực kỳ phức tạp bởi vì nó hoạt động theo cơ chế chỉ huy đa tầng và đa liên kết. Thí dụ, hệ
Quy trình tạo chuột chuyển gen (transgenic mice). Chiết tách các gen cần cấy vào cơ thể chuột, sau đó cấy gen này vào trứng chuột. Đưa trứng đã cấy gen này vào trong tử cung chuột mẹ trung gian để tạo ra thế hệ con cái có mang gen cần cấy.
thống thần kinh trung ương, tuần hoàn, hóa chất trong não, nội tiết tố cũng như đáp ứng miễn dịch là một mối quan hệ chằng chịt; và chúng ta không thể nào nghiên cứu các tiến trình bệnh lý ở các cơ phận này nếu không quan sát và thử nghiệm trên một cơ thể sống hoàn chỉnh.
Chuột và nghiên cứu y sinh học Chuột đến với phòng thí nghiệm được biết sớm nhất có lẽ là từ những người thích chơi chuột cảnh; họ nuôi và lai giống để có được những con chuột có màu lông lạ đời. Khởi thủy là từ những người chơi chuột Tàu (Chinese mouse) rồi lan sang Anh và Mỹ, thế nhưng chuột Tàu lại không phải là loại có bộ gen để sử dụng trong phòng thí nghiệm hiện đại.[6] Ở châu Âu, Robert Hook được coi là người đầu tiên sử dụng chuột để nghiên cứu thực nghiệm về oxy trong cơ thể sống vào năm 1614 (Masson JH 1940, trích dẫn lại[6]). Từ đó, việc sử dụng chuột với các chủng đặc biệt trở nên ngày càng phổ biến. Đáng ghi nhận nhất ở Mỹ là bà Abbie Lathrop, một giáo viên nghỉ hưu, thích chuột và nuôi chúng trong một trang trại của mình ở Massachusetts vào đầu thế kỷ XX.[7] Năm 1902, các dòng chuột nuôi của bà trở thành những con vật đầu tiên được Giáo sư Ernest Castle đưa vào phòng thí nghiệm của Đại học Harvard và sau đó là Đại học Pennsylvania, khi chúng được phát hiện thấy có mọc các khối u.
Chẳng bao lâu sau đó, học trò của Ernest là Clarence Cook Little (1888-1971) là người có công đầu trong việc tạo các giống chuột lai thuần chủng, lần đầu tiên được dùng trong nghiên cứu các bệnh ung thư có tính di truyền. Ông đã tạo ra giống chuột DBA (Dilute, Brown, Agouti),[8] tạm gọi là chuột thí nghiệm; các chủng chuột đầu tiên do Little lai tạo và vẫn thông dụng cho đến hiện nay là CBA, C3H, C57BL/6 và BALB/c. Little cũng chính là người đã thành lập Phòng thí nghiệm Jackson năm 1929,[9] cho đến nay vẫn là một trong những xưởng cung cấp các giống chuột thí nghiệm lai thuần chủng lớn nhất thế giới.
Những tiến bộ trong việc tạo giống chuột trong phòng thí nghiệm
Mặc dù chuột được sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu y sinh học, nhưng không phải tất cả các loại chuột đều dùng được. Các chủng chuột dùng trong nghiên cứu y sinh hiện đại đều phải có cấu trúc di truyền được xác định rõ. Và các chủng chuột đã xác định về mặt di truyền đều phải có cấu trúc giống hệt hoặc chí ít cũng rất sát nhau để có thể tái sinh sản theo cách cho lai thuần chủng các thế hệ trong thực nghiệm và để cho có thể tiên đoán được các kiểu hình (phenotype) cũng như các thành phần của allen.[10]
Những thập niên gần đây, các nhà khoa học đã có thể tạo ra những con chuột thí nghiệm có cấu trúc di truyền hoặc có kiểu hình bệnh lý theo ý muốn qua các phương thức chuyển hoặc tách gen. Chuyển và tách bỏ gen trong chuột để phục vụ cho mục đích nghiên cứu là một cuộc cách mạng trong công nghệ sinh học. Chuột chuyển gen là chuột được cấy vào cơ thể một gen ngoại lai và chuột tách gen là tách bỏ hoặc bất hoạt một hay một đoạn gen đặc hiệu nào đó.
Chuột nhà, tên khoa học là Mus musculus domesticus, được lựa chọn là mô hình nghiên cứu chuẩn trong phòng thí nghiệm y sinh do khả năng thích nghi cao và khả năng có thể lai tạo các dòng gen thuần chủng tiện lợi cho nghiên cứu các bệnh có liên quan mật thiết với bệnh lý ở người. Đặc biệt từ khi công nghệ chuyển và tách gen kỹ thuật cao ra đời, chuột càng chứng tỏ mình là một sự lựa chọn đúng đắn của con người trong nghiên cứu khoa học. Chẳng hạn một chủng chuột đặc hiệu, chủng 129, và các chủng phụ của nó được coi là đặc biệt giá trị do chúng có thể tạo các bào gốc phôi có khả năng thay đổi được cấu trúc di truyền trong quá trình nuôi cấy và
Hình ảnh của chuột tách gen (knockout mouse): Vai trò của gen Nh1h2 trong việc hình thành mỡ bụng và gây béo phì. Tại thời điểm 8 tuần tuổi cả hai chuột bình thường (WT) và chuột tách gen (KO) đều giống nhau về cấu trúc và trọng lượng cơ thể. Béo phì xuất hiện rõ rệt ở tuần thứ 12 và lớn hơn ở chuột đã được tách gen Nhlh2 do tăng nhanh lượng mỡ bụng và trọng lượng.
Nguồn:www.hnfe.vt.edu/People/faculty/good.html
rồi được đưa trở lại vào trong tử cung của chuột vật chủ.[11] Các nghiên cứu sử dụng biện pháp biến đổi gen trực tiếp của các chủng phụ nhóm 129 đã cho phép công nghệ tạo đột biến gen theo ý muốn (target mutation) để tạo ra các giống chuột có các đặc tính bệnh lý đặc hiệu, hay còn gọi là chuột chuyển gen (transgenic mouse) hoặc chuột tách bỏ gen (knockout mouse) cũng như các giống chuột có mang gen bệnh lý của người (chuột chuyển gen người, humanized mouse). Ngày nay việc sử dụng chuột chuyển gen trong phòng thí nghiệm y sinh đã trở nên phổ biến.
Đối với chuột hoang dại (rat), có lẽ chuột hoang dại ở Na Uy là được sử dụng trong nghiên cứu thực nghiệm phổ biến nhất, đặc biệt là trong giảng dạy. Giống như chuột nhà, chuột hoang dại được ưa chuộng là do khả năng sinh sản nhanh, đời sống ngắn, dễ kiếm và quan trọng hơn, chuột hoang dại có giá trị trong nghiên cứu đặc tính hành vi. Ngày nay, với những khám phá mới về khoa học thần kinh, khoa học thần kinh hành vi tạo cơ may để chuột hoang dại tiếp tục phát huy thế mạnh của mình trong nghiên cứu về các hành vi vận động, tấn công và sinh sản. So với chuột nhà, chuột hoang dại ít được sử dụng hơn trong phòng nghiên cứu y sinh hiện đại do hạn chế về khả năng tạo dòng lai thuần chủng. Từ khi công nghệ chuyển gen và tách gen ra đời, chuột hoang dại đang dần chiếm lại vị thế của nó trong phòng thí nghiệm do chuột hoang dại lại có hiệu quả hơn chuột nhà trong nghiên cứu các bệnh lý trên người như bệnh Parkinson, ung thư, xơ nang (cystic fibrosis), bệnh tim, bệnh Alzheimer, teo cơ giả phì đại và bệnh lý cột sống, vân..vân.[12]
Một số bệnh lý tái lập trên chuột chuyển gen hoặc chuột tách gen
Dựa trên các giả thuyết về bệnh lý gen, các nhà khoa học có thể tiến hành cấy các gen bệnh hoặc ghép các gen bệnh của người hoặc thậm chí loại bỏ một gen chức năng nào đó trong chuột để cho con chuột đó biểu hiện một bệnh lý nào đó giống hệt như bệnh lý ở người. Từ đó các nhà nghiên cứu có thể khảo sát tiến trình bệnh lý và mục đích cuối cùng là tìm ra một phương thức điều trị đặc hiệu khả dĩ có thể áp dụng điều trị cho người bệnh. Chỉ trong vòng hơn một thập niên gần đây, nghiên cứu chuyển, ghép và tách gen trên chuột đã đem lại nhiều kết quả khá thú vị và ngoạn mục. Dưới đây là ví dụ về một số bệnh lý điển hình tái lập được trên các mô hình chuột chuyển hoặc tách bỏ gen.
Bệnh Alzheimer (AD). Về cơ chế bệnh sinh, cho đến nay, các khoa học gia cho rằng do sự lắng đọng của các mảng protein có amyloid trên bề mặt não làm cho bệnh nhân mất trí nhớ, và tổn thương nhân cách là các đặc điểm của bệnh Alzheimer. Sử dụng chuột hoang dại chuyển gen đã có thể tái hiện lại mô hình bệnh lý này và các nhà nghiên cứu đang tiến hành khảo sát tác dụng của thuốc điều trị AD. Vừa mới đây, một nghiên cứu cho thấy rằng sử dụng một loại vắc-xin có chứa các protein amyloid biến thể cho chuột bị bệnh có khả năng làm chậm tiến trình bệnh lý AD. Hiện nay, vắc-xin này đang được thử nghiệm trên người.[13,14]
Bệnh lão suy (Aging). Nếu tiến hành theo dõi quá trình lão suy trên người, cần phải mất rất nhiều thời
gian, gần như suốt cả mấy thập niên đời người mà nhiều khi lại không thể theo dõi hết được. Trên mô hình nghiên cứu chuột hoang dại và chuột nhà cho thấy nếu giảm chế độ năng lượng thu nạp mỗi ngày, tuổi thọ của chuột hoang dại tăng lên, các quá trình thoái hoá sinh lý chậm lại và cho thấy có mối tương quan với khả năng ngăn ngừa một số bệnh lý liên quan đến tuổi tác.[15]
Ung thư. Trong suốt thập niên qua, những hiểu biết của chúng ta về vai trò các yếu tố môi trường có tác động như thế nào đến yếu tố di truyền và gây đột biến gen gia tăng nguy cơ ung thư là đều thông qua mô hình nghiên cứu trên chuột hoang dại và chuột nhà. Gần đây, các nhà khoa học đã tạo ra được giống chuột có khả năng kháng ung thư do thiếu khả năng sản xuất một protein vòng D1, một hợp chất tăng cao trong số các bệnh nhân ung thư vú. Do đó với kỳ vọng sử dụng liệu pháp trị liệu tác động vào chất này có khả năng làm kìm hãm sự phát triển ung thư vú ở người.[16]
Nhồi máu cơ tim (Heart attack). Nghiên cứu mới cho thấy rằng sau một đợt nhồi máu cơ tim, cơ tim tái sinh dài ra hơn một chút, là nguy cơ của suy tim và tái nhồi máu. Các nhà khoa học đang sử dụng mô hình chuột chuyển gen để nghiên cứu điều trị tình trạng này. Các nghiên cứu đang nhắm vào việc sử dụng các tế bào gốc tủy xương nguyên thuỷ tiêm vào vùng ngoại vi của khu vực bị tổn thương để kích thích việc tự sửa chữa, và kết quả đang theo chiều hướng hứa hẹn.[17]
Vài nhận xét và kết luận
Khoảng hơn một thế kỷ trước, mặc dù nhận thấy tầm quan trọng của chuột trong các nghiên cứu thực nghiệm y sinh học, các nhà khoa học vẫn chưa biết gì về DNA và yếu tố di truyền. Nhưng một sự ngẫu nhiên gần như có bàn tay sắp đặt, chuột càng ngày càng trở thành một đối tượng đóng một vai trò then chốt và không thể thay thế được trong nghiên cứu y sinh học hiện đại từ khi có công nghệ chuyển gen, tách gen ở chuột thí nghiệm, bởi vì nhờ công nghệ này mà chúng ta có thể tái hiện được khá nhiều bệnh lý ở người trên chuột thực nghiệm. Để sở hữu được một con chuột chuyển hay tách gen, cái giá phải chi trả không phải nhỏ. Một con chuột được tạo ra với bệnh viêm khớp giá xấp xỉ 200 USD/con; một con chuột mù bẩm sinh, 250 USD. Và nếu muốn có một con chuột được chuyển hay tạo đột biến hay tách gen theo ý muốn, bạn có thể phải chi trả đến giá 100 nghìn USD/con.[18] Và cũng không lạ gì là tại sao trong năm 2006, Viện Y tế Quốc gia Mỹ (NIH) đã phải chi trả đến 10 triệu đô la để mua 250 chủng chuột đã được tách gen, cùng với các dữ liệu chi tiết về sinh lý học.
Một điều thú vị hơn, sau các dự án giải mã bộ gen chuột và bộ gen người, các khoa học gia đặt sóng đôi để so sánh [19] thì thấy 90% bộ gen của chuột (hoang dại và nhà) giống với bộ gen người; ba loài này có chung với nhau trên 280 vùng rộng (large region) của các đoạn gen; và thậm chí có thể tái hiện các bệnh lý ở người trên chuột, thì chuột vẫn là chuột chứ không bao giờ chuột là người cả. Cấu trúc bộ gen không quan trọng mà hoạt tính, tương tác, điều khiển của các gen đó trong cơ thể mỗi loài mới quan trọng.
Sử dụng mô hình thực nghiệm trên động vật sống để nghiên cứu các bệnh lý ở người là điều gần như không thể thay thế được và nếu không nói là phương pháp tốt nhất và hiệu quả nhất hiện nay để tiếp cận cơ chế bệnh nguyên và bệnh sinh các bệnh lý ở người, đặc biệt là bệnh lý liên quan đến yếu tố di truyền. Nhưng điều đó không có nghĩa là một khi đã “giải mã” được bệnh lý và tìm được phương pháp chữa trị mới thành công trên mô hình động vật thực nghiệm là có được chìa khóa thành công trên con người, nếu không nói là đường đi đến đích vẫn còn xa dịu vợi. Cho nên, cho đến nay dưới ánh sáng của y học thực chứng, thì các bằng chứng nghiên cứu thu được từ mô hình thực nghiệm động vật vẫn là những bằng chứng có giá trị khoa học ở bậc rất thấp của thang điểm.
Nhưng dẫu sao, cũng cần phải có một cơ hội nào đó để tôn vinh loài chuột mà con người đã lỡ gán danh là “kẻ cắp”; vì bây giờ, con người đang đóng vai đó, đang ăn cắp những sở hữu quý giá của loài chuột để nghiên cứu phục vụ cho lợi ích của con người; và để có được những kết quả nghiên cứu mang tính đột phá trong y sinh học như hiện nay, không biết bao nhiêu con chuột đã phải làm vật thế thân mà tiếng xấu vẫn còn mang. Không biết có ngẫu nhiên hay không mà trong năm vừa qua, Walt Disney mới cho ra đời bộ phim hoạt hình Ratatouille, nâng cấp loài chuột lên ngang hàng với chúng ta, cũng xứng lắm thay!
Tài liệu tham khảo 1. Brothwell D (1981) The Pleistocene and Holocene archeology of the house mouse and related species. In Berry RJ (ed) Symposium of the Zoological Society of London Vol 47: The Biology of the House Mouse. Academic Press, London, pp 1-13.
2. Silver LM (1995) Mouse Genetics. Oxford University Press, New York.
3. Nutton V (1973) The Chronology of Galen's Early Career. Classical Quarterly 23:158-171.
4. California Biomedical Research Association (2007) CRBA Fact sheet: Why are Animals Necessary in Biomedical Research?
www.ca-biomed.org. Accessed Dec 12, 2007.
5. Foundation for Biomedical Research (2007) Rats and Mice, the Essential Need for Animals in Medical Research.
www.fbresearch.org. Accessed Dec 12, 2007.
6. Festing MFW, Lovell, DP (1981) Domestication and development of the mouse as a laboratory animal. In Berry RJ (ed) Symposium of the Zoological Society of London Vol 47: The Biology of the House Mouse. Academic Press, London, pp 43-62.
7. Morse III HC (1978) Origins of Inbred Mice. Academic Press, New York
8. Little CC (1913) "Yellow" and "Agouti" Factors in Mice. Science 38:205.
9. Russell ES (1978) Origins and history of mouse inbred strains: Contributions of Clarence Cook Little. In Morce HC (ed) Origins of Inbred Mice. Academic Press, New York, pp 33-43.
10.Davisson MT (1999) Genetic and Phenotypic Definition of Laboratory Mice and Rats/What Constitutes an Acceptable Genetic-Phenotypic Definition: Proceeding of the 1998 US/Japan Conference. In National Research Council (ed) The 1998 US/Japan Conference by International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. National Academy Press, Washington, D.C.
11. Simpson EM, Linder, CC, Sargent, EE, Davisson, MT, Mobraaten, LE, Sharp, JJ (1997) Genetic variation among 129 substrains and its importance for targeted mutagenesis in mice. Nat Genet 16:19-27.
12. Schulhof J (1996) Editorial: Putting your money where your mouse is. Lab Animal 25:9.
13. Schenk D, Barbour, R, Dunn, W, Gordon, G, Grajeda, H, Guido, T, Hu, K, Huang, J, Johnson-Wood, K, Khan, K, Kholodenko, D, Lee, M, Liao, Z, Lieberburg, I, Motter, R, Mutter, L, Soriano, F, Shopp, G, Vasquez, N, Vandevert, C, Walker, S, Wogulis, M, Yednock, T, Games, D, Seubert, P (1999) Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature 400:173-177.
14. Schenk DB, Seubert, P, Lieberburg, I, Wallace, J (2000) beta-peptide immunization: a possible new treatment for Alzheimer disease. Arch Neurol 57:934-936.
15. Masoro EJ (2000) Caloric restriction and aging: an update. Exp Gerontol 35:299-305.
16. Yu Q, Geng, Y, Sicinski, P (2001) Specific protection against breast cancers by cyclin D1 ablation. Nature 411:1017-1021.
17. Orlic D, Kajstura, J, Chimenti, S, Jakoniuk, I, Anderson, SM, Li, B, Pickel, J, McKay, R, Nadal-Ginard, B, Bodine, DM, Leri, A, Anversa, P (2001) Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 410:701-705.
18. Associated Press (2006) Mice play a critical role in medical research. Researchers can pay as much as $100,000 for a customized animal. In The Associated Press.
19.National Human Genome Research Institute (2004) Scientists Compare Rat Genome With Human, Mouse
http://wwwgenomegov/11511308 Accessed Feb 2, 2008.
http://www.ykhoanet.com/binhluan/nguyendinhnguyen/080206_nguyendinhnguyen_chuotysinh.htm
<bài viết được chỉnh sửa lúc 10.02.2008 12:09:35 bởi Quang Khôi >